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大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤 PC-12分化細胞操作步驟
更新時間:2025-06-25   點擊次數(shù):108次

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤 PC-12分化細胞操作步驟

分化誘導階段
當細胞密度達到60%-70%匯合時,更換為含1%馬血清和100ng/ml NGF(神經(jīng)生長因子)的低血清分化培養(yǎng)基。注意保持培養(yǎng)基pH值在7.2-7.4之間,每2天更換新鮮分化培養(yǎng)基。此階段需特別注意:①使用經(jīng)0.1%多聚賴氨酸預處理的培養(yǎng)皿增強細胞貼附;②培養(yǎng)箱濕度維持在95%以避免培養(yǎng)基蒸發(fā)造成的滲透壓變化。

形態(tài)學觀察
分化第3天起,在倒置相差顯微鏡下可觀察到特征性改變:胞體逐漸伸長,從圓形上皮樣向梭形神經(jīng)元樣轉變,并開始伸出細長突起。建議每日拍攝固定視野的時序照片,使用ImageJ軟件量化神經(jīng)突長度(≥2倍胞體直徑視為有效突起)。典型分化過程約需7-10天,當50%以上細胞呈現(xiàn)明顯神經(jīng)突時可判定分化成功。

 功能驗證
分化完成后可通過以下方法驗證:①免疫熒光檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和β-微管蛋白III表達;②鈣成像檢測細胞對高鉀溶液的鈣響應;③采用微電極陣列(MEA)記錄自發(fā)放電活動。注意實驗需設置未分化細胞對照組。
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注意事項
1. 嚴格把控NGF活性:分裝儲存于-80℃,避免反復凍融
2. 分化期間禁止使用胰蛋白酶消化,需換液時采用溫和的PBS沖洗
3. 出現(xiàn)過度聚集現(xiàn)象時,可加入2μM胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷抑制非神經(jīng)元細胞增殖。


 

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